Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la pigmentation et le mélanome par une approche translationnelle

En utilisant nos résultats précédents (Botton, T. et al., J Invest Dermatol (2009), Botton, T. et al. Cell death and differentiation (2011))  et des études de relations structure/activité en collaboration avec l'équipe du Dr. Benhida (Institut de Chimie de Nice, CNRS), nous avons développé et sélectionné des candidats (Thiazole Benzensulfonamides) présentant une forte capacité à induire la mort des cellules de mélanome avec HA15 comme composé principal de cette série. Il est intéressant de noter que HA15 induit la mort de toutes les lignées de mélanome testées indépendamment de leur statut mutationnel et qu'il est également efficace sur des cellules de mélanome fraîchement isolées de patients sensibles ou résistants aux inhibiteurs de BRAF. HA15 a montré une forte efficacité dans les modèles de xénogreffe de souris utilisant des cellules de mélanome sensibles ou résistantes aux inhibiteurs de BRAF sans aucun signe de toxicité. Nous avons ensuite réalisé des études pangénomiques, protéomiques et biochimiques afin de décrypter le mécanisme d'action et identifier la cible des meilleurs candidats. Nous avons identifié la protéine BIP (également connue sous le nom de GRP-78 ou HSPA5), une protéine du réticulum endoplasmique (RE), comme étant la cible spécifique de notre composé. Nous avons démontré que l'interaction entre notre composé et BIP augmente le stress du réticulum endoplasmique et entraîne la mort des cellules de mélanome par induction concomitante de l'autophagie et de l'apoptose. La surexpression du BIP a été décrite dans divers cancers. Il n'est donc pas surprenant que cette molécule se soit également révélée active contre d'autres tumeurs liquides et solides. Prises ensemble, nos données suggèrent que notre molécule a un impact important sur l'inhibition de la croissance du mélanome en ciblant le stress du RE et pourrait donc être développée pour le traitement des patients atteints de mélanome et d'autres cancers en général. Ces travaux ont conduit à la publication de plus de 12 et au dépôt de 4 brevets internationaux sous licence. En juillet 2021, nous avons cofondé une start-up de biotechnologie appelée Biper Therapeutics (https://www.biper-tx.com/) qui développe des petites molécules de première classe pour traiter les cancers orphelins résistants par la modulation du stress du réticulum endoplasmique, une voie unique pour aborder la résistance au cancer.

Nous avons précédemment démontré que la metformine, un médicament antidiabétique, pouvait exercer des effets anti-prolifératifs et anti-invasifs sur le mélanome in vitro et in vivo (Tomic, T. et al., Cell Death & Disease, 2011, Cerezo, M. et al., 2013). Suite à cette preuve de concept, nous avons conçu une étude clinique pilote, en collaboration avec le service de dermatologie de l'hôpital de Nice, afin d'évaluer l'efficacité du traitement par metformine chez des patients atteints de mélanome métastatique avancé. Malheureusement, nous n'avons pas observé d'effet thérapeutique de la metformine en monothérapie (Montaudié et al, PCMR, 2017). Ceci peut être expliqué, sur la base de la littérature récente, par la faible biodisponibilité de la metformine dans la tumeur. Pour pallier cette limitation, nous avons testé un dérivé de la metformine développé grâce à une approche structure/fonction réalisée avec l'Institut de Chimie de Nice. Cette collaboration nous a permis d'identifier le composé breveté, CRO15, possédant une IC50 2000 fois plus faible que celle de la metformine. L'efficacité in vitro de CRO15 sur les cellules de mélanome indépendamment de leur contexte mutationnel et de leur statut de résistance aux thérapies ciblées ainsi que son innocuité sur les cellules normales ont été confirmées sur des modèles in vivo. D'un point de vue mécanistique, de faibles doses (de l’ordre du micromolaire) de CRO15 diminuent l'OXPHOS, activent l'AMPK et inhibent mTOR, ce qui conduit à l'induction de l'autophagie et à l'apoptose. Il est intéressant de noter que CRO15 inhibe également un nombre limité de kinases, telles que MELK, impliquées dans des voies oncogèniques clés (Jaune et al., CDDis, 2021). Ainsi, associé à l'absence apparente de toxicité, cette action combinée suggère un potentiel intéressant du CRO15 pour combattre la résistance aux traitements dans le mélanome.

Afin de continuer à explorer les mécanismes de résistance des mélanomes, notamment en réponse aux inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI), nous avons développé un nouveau programme de recherche visant à décrypter la reprogrammation des voies métaboliques favorisant la résistance des mélanomes à l'immunité anti-tumorale. En effet, les immunothérapies étant la première classe de traitement qui cible les cellules immunitaires et non directement les cellules tumorales elles-mêmes, la compréhension de l'interaction entre les différents membres du microenvironnement tumoral (MET) est cruciale pour améliorer la réponse thérapeutique. En raison de la forte consommation de nutriments par les cellules cancéreuses et des défauts de vascularisation, le MET est souvent pauvre en nutriments et en oxygène, ce qui entraîne une compétition pour l'accès aux nutriments entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales. Ainsi, la manipulation du métabolisme tumoral apparaît comme la clé de voûte de nouvelles stratégies visant à améliorer la réponse aux immunothérapies et à contourner la résistance (Cerezo et al., Cell Death Dis., 2020).

Les acides aminés (AA) étant essentiels pour la synthèse des protéines et particulièrement nécessaires pour soutenir la croissance rapide des cellules cancéreuses, les adaptations métaboliques soutenant la synthèse des AA semblent être des cibles intéressantes pour améliorer la réponse des mélanomes aux immunothérapies. Il est intéressant de noter qu'en utilisant l'analyse métabolomique et fluxomique, nous avons identifié des altérations métaboliques dans les mélanomes résistants aux ICI à l'intersection du cycle de l'urée et de la synthèse de novo des pyrimidines, avec une augmentation particulière de la synthèse de l'arginine. Il est intéressant de noter que l'enzyme limitant la vitesse de la voie de synthèse de l'arginine, ASS1, est régulée à la hausse dans les échantillons de patients résistants à l'ICI par rapport aux répondeurs. L'arginine étant connue pour être appauvrie dans le MET, notre hypothèse est que cette augmentation de la capacité de synthèse de l'arginine rend les cellules résistantes moins auxotrophes, leur donnant un avantage prolifératif suffisant pour surmonter l'immunité anti-tumorale. Sur la base de ces données préliminaires, les objectifs de notre projet sont de déchiffrer comment la reprogrammation métabolique entraîne la résistance aux ICI et de déterminer si ces altérations métaboliques peuvent servir de biomarqueurs et/ou de cibles exploitables pour contourner la résistance.

CLEC12B est un récepteur de type C de la famille 12 membre B et notre travail illustre parfaitement comment la compréhension de la biologie des mélanocytes normaux peut avoir des implications directes dans l'étude du mélanome. Peu de choses sont décrites à propos de CLEC12B dans la littérature, si ce n'est qu'il s'agit d'un récepteur inhibiteur présent sur les cellules myéloïdes, dont la fonction dépend du recrutement des phosphatases SHP-1 et SHP-2. Depuis que notre équipe a identifié CLEC12B comme un gène mélanocytaire de premier plan dans l'analyse du transcriptome (Regazzetti et al., 2015), deux projets de doctorat distincts ont été mis en place pour étudier son rôle dans la pigmentation et dans le mélanome. Ces projets étaient techniquement difficiles car très peu d'outils scientifiques étaient disponibles pour étudier cette molécule. Le premier de ces projets démontre que dans la peau, CLEC12B est sélectivement exprimée dans les mélanocytes producteurs de pigments et que son expression est diminuée dans la peau hautement pigmentée par rapport à la peau blanche (Sormani et al., JID 2021). CLEC12B contrôle directement la production de mélanine et la pigmentation via le recrutement et l'activation de SHP-1 et SHP-2 par le biais de son motif ITIM.  Le mécanisme implique également la dégradation de CREB et la régulation négative de la voie MITF (le régulateur principal de la fonction mélanocytaire). Cette découverte d'un nouveau gène qui régule la couleur de notre peau est une perspective excitante pour le développement d'agents mélanogènes dans les domaines clinique et cosmétique et, en parallèle, nous fournit de nouvelles perspectives dans la compréhension de la biologie des mélanocytes et la régulation de la mélanogénèse.

Le second projet a porté sur le rôle de CLEC12B dans le mélanome. Ces résultats ont montré une expression réduite de CLEC12B dans les métastases de mélanome par rapport aux lésions mélanocytaires bénignes (Montaudie et al., JID 2021). CLEC12B est corrélé avec un mauvais pronostic des patients et les souris greffées avec des cellules de mélanome humain surexprimant CLEC12B présentent une diminution de la croissance tumorale. Ces résultats suggèrent que CLEC12B pourrait être un nouveau gène suppresseur de tumeur dans le mélanome. Les mécanismes centraux de son effet sont à nouveau le recrutement de SHP-2 par son domaine ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) avec une inactivation parallèle de STAT-1, 3 et -5 mais une activation de la voie p53/p21/p27. Les résultats obtenus dans le cadre de ces projets sont protégés par un brevet d'INSERM Transfert (EP/08.06.17/EPA17305681).

A- L'apoptose médiée par CXCR3B est à l'origine de la réactivité des cellules T dans le vitiligo.

Dans ce projet translationnel et multidisciplinaire impliquant des collaborations au sein de notre centre, de notre hôpital sur place et des chercheurs cliniques de plusieurs départements hospitaliers différents, nous avons cherché à découvrir comment le vitiligo se déclenche, dans l'optique de pouvoir prévenir son développement précoce et, par la suite, la maladie à long terme. Nous nous sommes concentrés sur le système immunitaire inné car les données transcriptomiques précédentes de notre laboratoire avaient suggéré que les gènes associés à l'activation de l'immunité innée étaient régulés à la hausse dans la peau lésionnelle des sujets atteints de vitiligo non segmentaire ou généralisé par rapport à la peau saine (Regazzetti et al, JID 2015). Dans cette étude, nous avons montré, pour la première fois, que l'activation des cellules immunitaires innées (natural killer et lymphocytes innés de type I) dans la peau d'apparence normale est un déclencheur précoce de l'initiation du vitiligo. Ce processus est initié par des PAMPs et DAMPs endogènes ainsi que par un stress extracellulaire (oxydatif) qui pousse les cellules innées à produire une grande quantité d'IFN, ce qui entraîne directement la régulation à la hausse de CXCR3B sur les mélanocytes humains. Auparavant, on pensait que CXCR3 n'était exprimé que par les cellules T (CXCR3A). Nous avons montré ici que les mélanocytes eux-mêmes expriment ce récepteur de chimiokine, mais de l'isoforme B. Il est important de noter que les patients atteints de vitiligo avec une augmentation de l'IFN circulant ont une forte expression basale de CXCR3B. L'activation de CXCR3B par CXCL10 déclenche directement l'apoptose de certains mélanocytes et, chez d'autres, augmente leur expression de marqueurs de co-stimulation (CD40 et HLA-DR) et de molécules d'adhésion (ICAM-1), ce qui induit la prolifération des cellules T et la destruction ultérieure des mélanocytes par le système immunitaire adaptatif. Ensemble, ces résultats ont permis d'élucider les mécanismes impliqués dans le déclenchement de la chaîne initiale d'événements qui conduit finalement à la pathogenèse de la maladie qu'est le vitiligo (Tulic et al., Nat Com 2019). Nous avons récemment étendu ces études aux patients atteints de vitiligo segmentaire (Passeron et al., JID 2021). Ces résultats novateurs sont protégés par INSERM Transfert sous la forme de deux brevets (EP18305161 et PCT/EP2019/053767), les manuscrits ont reçu beaucoup d'attention (comme en témoignent les invitations locales et internationales) et ont revendiqué un Prix du meilleur article de 2019 (Fonds de Dotation 'Pour sa Peau, Pour sa Vie'). Ensemble, ces données indiquent que la réduction du stress local et le ciblage direct de CXCR3B pourraient constituer des approches efficaces pour stopper l'initiation de la maladie. En parallèle, mieux comprendre comment le système immunitaire cible les mélanocytes normaux pourrait ouvrir de nouvelles voies pour l'amélioration des immunothérapies contre le mélanome.

B-Dysbiose du microbiote cutané comme facteur contribuant au vitiligo 

Bien que les études génétiques aient identifié plus de 50 loci de susceptibilité au vitiligo, le retard dans l'âge d'apparition du vitiligo au cours des 30 dernières années souligne le rôle clé des facteurs environnementaux dans le déclenchement du vitiligo. Comme nous l'avons indiqué dans nos publications les plus récentes, les cellules immunitaires innées des sujets atteints de vitiligo réagissent davantage au stress qui peut être déclenché par des PAMPs. Les bactéries sont parmi les principaux producteurs de PAMPs et peuvent induire une réponse immunitaire innée dans le vitiligo. Nous savons que les dysbioses commensales cutanées ou intestinales ont été associées à divers troubles dermatologiques. Ce projet de 3 ans (financé par ISISPharma) fait l'objet du thème de recherche de notre doctorante (Mme Hanene Bzioueche). Pour cette étude, nous avons étudié des échantillons appariés de selles (intestin), de peau et de sang de patients atteints de vitiligo et de témoins sains, en échantillonnant les couches superficielles (épiderme, écouvillon) et profondes (derme, biopsies) de la peau. Les écouvillons et les biopsies ont été prélevés sur des sites lésionnels et non lésionnels de sujets atteints de vitiligo. Dans cette étude la plus récente, nous avons été en mesure d'identifier les souches bactériennes qui sont enrichies et celles qui sont appauvries dans la peau du vitiligo (Bzioueche et al., JID 2021) ; ces dernières que nous prévoyons de cibler pour une intervention clinique. De manière importante, nous avons montré que le microbiote de la biopsie dans la peau lésionnelle a une composition distincte et est associé au stress mitochondrial et aux changements de la fonction immunitaire innée détectés dans le sang des mêmes sujets. Enfin, nous avons démontré que les changements dans la peau sont également observés dans l'intestin des mêmes individus, montrant une augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes, similaire à ce qui a été décrit pour d'autres maladies auto-immunes et donnant ainsi un soutien à l'axe intestin-peau dans le vitiligo, cependant ce dernier reste à être formellement testé.